产品包装：

自备试剂及耗材：

吸头/离心管

实验步骤：

1. Rhodamine 123染色工作液的配制：

a. 6孔板每孔所需Rhodamine 123染色工作液的量为1ml，其它培养器皿的Rhodamine 123染色工作液的用量以此类推；对于细胞悬液每50-100万细胞需0.5ml Rhodamine 123染色工作液。

b. 取适量Rhodamine 123 (1000X)，按照每1µl Rhodamine 123 (1000X)加入1ml检测缓冲液的比例稀释Rhodamine 123，混匀后即为Rhodamine 123染色工作液。

注1：配制Rhodamine 123染色工作液时注意避光，且须现配现用，不能长期保存。

注2：本试剂盒中提供的检测缓冲液含有Ca2+，能够在一段时间内维持细胞的正常状态，并给细胞提供一定的营养，效果比PBS或HBSS更好；检测缓冲液也可用细胞培养液代替，但培养液中不能含有血清，否则会影响Rhodamine 123的染色效果。

注3：染色工作液中Rhodamine 123的最终浓度需根据不同细胞系和实验体系通过预实验进行优化。Rhodamine 123的推荐工作浓度为1X，可以在0.1X-5X范围内摸索最佳工作浓度。

2. 阳性对照的设置：

把试剂盒中提供的CCCP (10mM)推荐按照1:1000的比例加入到细胞培养液中，稀释至10µM，处理细胞20分钟。随后按照下述方法加入Rhodamine 123染色工作液，进行线粒体膜电位的检测。对于大多数细胞，通常10µM CCCP处理20分钟后线粒体的膜电位会完全丧失，Rhodamine 123染色后观察应呈弱黄绿色或几乎无荧光；而正常的细胞经Rhodamine 123染色后应显示明亮的黄绿色荧光。对于特定的细胞，CCCP的作用浓度和作用时间可能有所不同，需自行参考相关文献资料或自行摸索确定。

3. 对于悬浮细胞：

a. 细胞按照实验设计进行一定处理后，计数。取适量细胞600×g室温离心5min，弃上清，加入适当体积的Rhodamine 123染色工作液重悬细胞，使细胞密度约为1×106/ml。

b. 细胞培养箱中37ºC孵育20-60min，不同的细胞最佳孵育时间不同。以20min作为初始孵育时间，对孵育时间进行适当优化以得到最佳的效果。

c. 37ºC孵育结束后，600×g室温离心5min，沉淀细胞。吸除上清，注意尽量不要触及细胞。

d. 用37ºC预热的细胞培养液洗涤2次：加入1ml 37ºC预热的细胞培养液重悬细胞，离心5分钟，沉淀细胞，弃上清；重复一次。

e. 再用适量细胞培养液重悬后，用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察，也可以用荧光酶标仪或流式细胞仪分析。

4. 对于贴壁细胞：

注意：对于贴壁细胞，如果希望采用荧光酶标仪或流式细胞仪检测，可以先收集细胞，重悬后参考悬浮细胞的检测方法。荧光酶标仪如果能采用底读的方式进行荧光检测，也可以使用96孔板等进行贴壁培养检测的。

a. 对于6孔板的一个孔的细胞，吸除培养液，根据具体实验如有必要可以用PBS或其它适当溶液洗涤细胞一次

b. 加入1ml Rhodamine 123染色工作液。细胞培养箱中37ºC孵育20-60min，不同的细胞最佳孵育时间不同。以20min作为初始孵育时间，对孵育时间进行适当优化以得到最佳的效果。

c. 37ºC孵育结束后，吸除上清，用预热的细胞培养液洗涤2次。

d. 加入2ml预热的细胞培养液，培养液中可以含有血清和酚红。

e. 荧光显微镜或激光共聚焦显微镜下观察。

5.对于纯化的线粒体：

a. 准备好Rhodamine 123染色工作液。

b.  0.9ml Rhodamine 123染色工作液中加入0.1ml总蛋白量为10-100µg纯化的线粒体。

c. 用荧光酶标仪或荧光分光光度计检测：混匀后直接用荧光分光光度计进行时间扫描(time scan)，激发波长为507nm，发射波长为529nm。如果使用荧光酶标仪，可在软件中把检测对象设置为FITC，即可以检测Rhodamine 123。另外，也可以参考下面步骤6中的波长设置进行荧光检测。

d. 用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察：方法同下面的步骤6。

6. 荧光观测和结果分析：

Rhodamine 123的最大激发波长为507nm，最大发射波长为529nm。如使用荧光显微镜观察，可以参考观察FITC等其它绿色荧光时的设置。黄绿色荧光变弱说明线粒体膜电位下降，并且该细胞很可能处于细胞凋亡早期。通过对比实验组与阴性对照组测量的Relative fluorescence values (RFU)，可以得出药物处理后线粒体内Rhodamine 123探针荧光强度的变化。此处的阴性对照为仅含检测缓冲液的未经染色的细胞样品。

注：流式检测应获得两个相对独立的细胞群：明亮绿色荧光的正常细胞群和弱绿色荧光的凋亡或坏死细胞群。

注意事项：

1. 荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

2. 本试剂盒仅限于用于存活的细胞或组织的检测，不可用于固定或冻存的细胞或组织样品的检测。

3. 检测缓冲液经过过滤除菌处理，在使用时须注意避免微生物污染，否则很可能严重影响染色效果。如果检测缓冲液发生浑浊等明显的微生物污染，就不能继续使用。

4. CCCP为线粒体电子传递链抑制剂，对人体有害，操作时请小心，并注意有效防护以避免直接接触人体或吸入体内。

5. 荧光酶标仪检测时须使用适合荧光检测的黑板或白板，建议使用96孔黑板。

6. 本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

7. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

本产品在文章中的写法：

英文： Dowobio （Shanghai，China）

中文： 上海多沃生物科技有限公司  Dowobio，上海