本试剂盒采用碱裂解法裂解细胞，再通过离心吸附柱在高盐状态下特异性地结合溶液中的DNA。

产品内容

产品简介

本试剂盒采用碱裂解法裂解细胞，再通过离心吸附柱在高盐状态下特异性地结合溶液中的DNA。离心吸附柱中采用的硅基质材料为本公司新型材料，高效、专一吸附DNA。以下操作步骤适用于提取1-5 ml过夜培养的大肠杆菌，质粒提取得率和质量与宿主菌的种类和培养条件、细胞的裂解、质粒拷贝数、质粒的稳定性、抗生素等因素有关。使用本试剂盒提取的质粒DNA可适用于各种常规操作，包括酶切、PCR、测序、连接、转化、文库筛选、体外翻译、转染一些常规的传代细胞等

提取得率

1．溶液P1在使用前先加入RNase A（将试剂盒中提供的RNase A全部加入），混匀，置于2-8℃保存。注意事项（请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项。）

2．使用前请先检查平衡液BL、溶液P2和P3是否出现浑浊，如有混浊现象，可在37℃水浴中加热几分钟，即可恢复澄清。

3．注意不要直接接触溶液P2和P3，使用后应立即盖紧盖子。

4．所有离心步骤均为使用常规台式离心机室温下进行离心，速度为12000 rpm(~13400×g)。

5．提取的质粒量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。

6．实验前使用平衡液BL处理吸附柱，可以充分激活硅基质膜，提高得率。

7．用平衡液BL处理过的柱子最好当天使用，放置时间过长会影响效果。

8．去蛋白液PD可以有效去除残留的蛋白污染，当宿主菌为endA+（TG1、BL21、HB101、ET12567、JM系列）等核酸酶含量较高的菌株时，强烈推荐使用去蛋白液PD。

操作步骤

使用前请先在漂洗液PW中加入无水乙醇，加入60ml无水乙醇。

1.柱平衡步骤：向吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）加入500μl的平衡液BL，12000 rpm(~13400×g)离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。（请使用当天处理过的柱子）

2.取1-5 ml过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12000 rpm(~13400×g)离心1 min，尽量吸除上清（菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）。3.向留有菌体沉淀的离心管中加入250μl溶液P1（请先检查是否已加入RNase A），使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。注意：如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。

4向离心管中加入250μl溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。注意：温和地混合，不要剧烈震荡，以免打断基因组DNA，造成提取的质粒中混有基因组DNA片断。此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5 min，以免质粒受到破坏。如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。

5.向离心管中加入350μl溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12000 rpm(~13400×g)离心10 min。注意：P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。

6.将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中），注意尽量不要吸出沉淀。12000 rpm(~13400×g)离心30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。

7.可选步骤：向吸附柱CP3中加入500μl去蛋白液PD，12000 rpm(~13400×g)离心30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3重新放回收集管中。如果宿主菌是end A+宿主菌（TG1，BL21，HB101，JM系列，ET12567等），这些宿主菌含有大量的核酸酶，易降解质粒DNA，推荐采用此步。如果宿主菌是endA宿主菌（DH5α，TOP10等），这步可省略。

8.向吸附柱CP3中加入600μl漂洗液PW（请先检查是否已加入无水乙醇），12000 rpm(~13400×g)离心30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。

9.重复操作步骤8。

10.将吸附柱CP3放入收集管中,12,000 rpm(~13,400×g)离心2 min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。为确保下游实验不受残留乙醇的影响，建议将吸附柱CP3开盖，置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

11.将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50-100μl洗脱缓冲液EB，室温放置2 min，12000 rpm(~13400×g)离心2 min将质粒溶液收集到离心管中。

注意：洗脱缓冲液体积不应少于50μl，体积过小影响回收效率。洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若后续做测序，需使用ddH2O做洗脱液，并保证其pH值在7.0-8.5范围内，pH值低于7.0会降低洗脱效率。且DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。为了增加质粒的回收率，可将得到的溶液重新加入吸附柱中，室温放置2 min，12000 rpm(~13400×g)离心2 min，将质粒溶液收集到离心管中。低拷贝或大质粒（>10 kb）提取如果所提质粒为低拷贝质粒或大于10 kb的大质粒，应加大菌体使用量，使用5-10 ml过夜培养物，同时按照比例增加P1、P2、P3的用量，洗脱缓冲液EB应在65-70℃水浴预热，在吸附和洗脱时可以适当的延长时间，以增加提取效率。其它步骤相同。

储存条件

该试剂盒置于室温(15-25℃)干燥条件下，可保存12个月，更长时间的保存可置于2-8℃。2-8℃保存条件下，若溶液产生沉淀，使用前应将试剂盒内的溶液在室温放置一段时间，必要时可在37℃水浴中预热10 min，以溶解沉淀。第一次使用前将RNase A加入溶液P1中，混匀后置于2-8℃保存，可稳定保存12个月以上。单独包装的RNase A在室温可稳定保存12个月以上。