Taq SYBR®Green qPCR Premix是SYBR®Green I嵌合染料法专用qPCR试剂，为2×预混液，包含除引物和DNA样品以外的所有qPCR组分，可减少操作步骤，缩短加样时间，降低污染几率。

产品简介

Taq SYBR®Green qPCR Premix是SYBR®Green I嵌合染料法专用qPCR试剂，为2×预混液，包含除引物和DNA样品以外的所有qPCR组分，可减少操作步骤，缩短加样时间，降低污染几率。其核心组分是经抗体修饰的热启动Taq DNA聚合酶，配合精心优化的Buffer体系以及PCR反应促进因子，使产品具有特异性强、扩增效率高等特点，有效抑制非特异性扩增，可对宽广浓度范围的模板进行准确定量，获得稳定可靠的qPCR结果。预混液中含有独特校正染料，与一系列qPCR设备兼容，包括需要ROX校正的仪器，实验操作过程中不需要额外添加染料来校正仪器。

使用方法

1.使用注意

① 因Mix中预混有染料，其保存或反应体系配制过程应避免强光照射；

② 使用前上下颠倒轻轻混匀Mix，请勿涡旋振荡混匀，避免产生过多气泡；

③ Mix中含有Universal校正染料，适用于所有机型，无需额外添加染料。

2.建议的qPCR反应体系

a.通常推荐的引物终浓度为0.2μM，反应效果不佳时可在0.1~1μM范围内进行调整；

b.推荐模板加样量为1~2μl，如模板类型为未稀释cDNA原液，模板添加量不应超过总反应体系的10%。不同种类DNA模板中含有的靶基因拷贝数目不同，必要时可进行梯度稀释，以确定最佳的DNA模板添加量。

3.qPCR反应程序（可根据机型适当调整）

两步法

退火延伸40个循环

三步法

a.根据引物的Tm值进行退火&延伸（退火）温度的设定；若扩增片段在200 bp以内，退火&延伸（延伸）时间可以设置为15 sec；此外，退火&延伸（延伸）时间的设置还需根据您使用的qPCR仪所需要的最短数据采集时间自行调整；

b.不同qPCR仪的熔解曲线采集程序有差别,一般可使用仪器默认的熔解曲线采集程序。

4.实验优化

若使用默认反应条件反应性能不佳时，则需要进行反应条件的优化，可以从引物浓度以及扩增程序两个方面进行：

① 引物浓度调整

当引物终浓度在0.1~1.0μM范围之间变化时，引物浓度越低，扩增特异性越高，但扩增效率会有所下降。

② 扩增程序优化

需提高扩增特异性，可使用两步法程序或提高退火温度；需提高扩增效率，可使用三步法程序或延长延伸时间。

5.引物设计原则

① 扩增产物长度建议控制在80~200 bp；

② 引物长度为18~25 bp；

③ 正向引物和反向引物的Tm值相差不超过1℃为佳，Tm值控制在58~62℃为佳；

④ 引物的GC含量控制在40%~60%之间；

⑤ 引物A、G、C、T整体分布尽量要均匀，避开T/C或者A/G的连续结构（特别是3'端）；

⑥ 引物3'端最后一个碱基最好为G或者C；

⑦ 避开引物内部或者两条引物之间的互补序列；

⑧ 使用NCBI BLAST功能检索确认引物的特异性。