SYBR™ Green qPCR Mix-UDG
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产品编号
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产品名称
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包装规格
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储存、效期
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MI00626
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SYBR™ Green qPCR Mix-UDG
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2*1.25ml
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-20°C，有效期1年
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产品描述
带有ROX的SYBR®Green qPCR Mix-UDG是一种即用型实时定量PCR(qPCR)混合试剂，它可在支持ROX参考染料的仪器中用于DNA的扩增与检测。产品包括SYBR®Green I荧光染料和方便即用的Mix配方，可在很广的目的浓度范围内提供极高灵敏度的目的序列定量检测。混合试剂配方及UDG防止残余污染技术也使该试剂适用于高通量定量PCR。
在RNA的定量检测过程中，本Mix可用于两步法定量RT-PCR（qRT-PCR）。
试剂组成组分
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试剂组分
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体积
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SYBR® Green qPCR Mix-UDG
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2*1.25ml
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50 mM 氯化镁 (MgCl2)
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1,ml
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使用指南和各项参数
模板
实时定量PCR中使用的目的模板可以是从RNA获得的cDNA（定量RT-PCR）或质粒或基因组DNA。为了获得最佳结果，扩增片段的长度应为80–250 bp。
镁离子浓度
带有ROX的SYBR®Green qPCR Mix-UDG中包含终浓度为3 mM的氯化镁。可以调整镁离子的工作浓度以获得最佳扩增效果。如有需要，可使用该试剂盒中提供的50mM氯化镁以提高镁离子浓度。
使用下表来确定达到特定浓度需另外加入的MgCl2量（包含25μl带有ROX的SYBR®Green qPCR Mix-UDG的50μl反应体系）：
MgCl2终浓度（需加入的50mM MgCl2量（每50μl反应体系）
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镁离子浓度
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加入体积
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4.0 mM
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1 μl
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5.0 mM
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2 μl
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6.0 mM
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3 μl
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备注：反应体系中水的用量需相应地减少
处理条件
避免带有 ROX 的 SYBR® Green qPCR Mix-UDG 受到阳光直射。阳光直射时间过长可能会导致荧光信号强度下降。
循环程序和方案
PCR 是一种可以将微量 DNA 进行扩增的有效技术，因此必须采取各种预防措施避免出现交叉污染。在对仪器进行设置并准备好反应混合试剂后，按下表所述步骤进行操作。
注：这些循环条件被推荐作为起始点和使用指南。最佳循环温度因目的序列、引物设计和仪器的不同而异。
循环程序
三步循环 两步循环
50°C 持续2 分钟 50°C 持续2 分钟
95°C 持续2 分钟 95°C 持续2 分钟
45 个循环： 50 个循环：
95°C，15 秒 95°C，15 秒
55°C，30 秒 60°C，30 秒
72°C，30 秒
熔解曲线分析：参考仪器文件
预混液配比方案
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试剂
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50ul反应体系（1次反应）
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50ul反应体系（50次反应）
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SYBR® Green qPCR Mix-UDG
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25 μl
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1250 μl
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正向引物，10 μM
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1 μl
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50 μl
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反向引物，10 μM
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1 μl
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50 μl
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高压灭菌的蒸馏水*
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补至 40–45 μ
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补至 2000-2250 μl
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* 水的使用量根据50μl反应体系中加入的模板体积确定（参见下述实验方案）
实验方案
1.设置实时PCR仪的程序，使之在PCR扩增前进行短暂的UDG孵育，如上循环程序所述。最佳循环温度因目的序列、引物设计和仪器的不同而异。
2.准备如上所述除模板外的预混液。注：在定量PCR反应中，制备预混液以减少吸液误差是至关重要的。
3.每个反应，将40–45μl的预混液加入到0.2-ml微型离心管或96-孔PCR板的每个孔中。
4.加入5–10μl的样品模板（cDNA、基因组DNA或质粒DNA；至各反应容器中，盖上或密封反应管/板。
5.轻轻混匀，确保所有组分都在反应容器底部。如果需要，可以稍微离心。
6.将反应体系置于如上设置的基因扩增仪中。收集数据并分析结果。循环结束后，如果需要，可将反应体系置于4°C以作进一步分析。
