Taq DNA聚合酶是一种热稳定酶，在适合的体系，特定引物和dNTPs存在的情况下，可以根据已解链的模板合成DNA。

产品组分

1.简介

Taq DNA聚合酶是一种热稳定酶，在适合的体系，特定引物和dNTPs存在的情况下，可以根据已解链的模板合成DNA。我们的产品Taq DNA Polymerase是一种重组酶，分子量约为94kd。

Taq DNA聚合酶具有5'→3'DNA聚合酶和微弱的5'→3'核酸外切酶的能力，但没有3'→5'外切酶的能力，这意味着在3'末端会出现dA突出。利用该特征，可以将dA添加到平端的3'末端，用于TA克隆。在PCR反应中，对于大多数模板，Taq DNA聚合酶的延伸速度通常为1kb/min，对于高复杂性的基因，它可能需要1-2kb/min。

该Master Mix含有染料，这意味着它可以在扩增后直接进行电泳，无需添加上样缓冲液。

如果模板具有更多的二级结构，更高的GC含量或是长度超过5 kb，您可能需要更多优化。

2.配置PCR反应体系

如下表配置您的PCR反应体系，或使用您自己的体系和条件。

完全解冻Master Mix和各个组分，在使用前混合并短暂离心。我们建议在冰上配置所有反应组分。

注意点：

a.模板可以是cDNA，gDNA或λDNA。

b.Taq DNA聚合酶的最终浓度为1U/50μl反应体系。

将反应管混合并短暂离心。立即转移到PCR仪。

3.PCR循环条件

在PCR仪中进行反应。

注意点：

a.您可以使用从Tm减去3-5度（两个Tm中较低的一个）的退火温度。以下是简略的计算公式：

当引物短于20bp时，Tm（℃）=4（G+C）+2（A+T）。

当引物长于20bp时，Tm（℃）=81.5+0.41*（GC的％）-（675/长度）

您也可以使用温度梯度来确定退火温度。

对于一些高度复杂的基因组DNA或cDNA模板，延伸时间可以增加到每kb 90秒。

4.电泳

该Master Mix含有染料，可在PCR结束后直接进行电泳，无需添加上样缓冲液。如果您需要对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，可以使用我们的产品SYBR Safe DNA Gel Stain。您可以将PCR产品立即用于下游应用，或将其储存在-20°C。

5.注意点

5.1.PCR反应应在无杂质DNA污染的环境中进行。建议使用“干净”的专用自动移液枪和喷雾阻挡枪头。始终保持阳性/阴性对照DNA或其他模板与其他组分分开。使用的PCR管应当不含核酸酶。

5.2.常用的寡核苷酸引物长度通常为20-40个核苷酸，最好具有约40-60％的GC含量。反应中每种引物的最终浓度可以是在0.05-1μM范围中间，通常是0.1-0.5μM。

5.3.可以使用添加剂（例如DMSO或甲酰胺）改善一些难以扩增的模板的反应体系，如富含GC的序列。

5.4.对于难以扩增的模板，例如富含GC的序列，建议在PCR循环之前进行更长的初始变性，例如在95°C下5分钟，以使模板完全变性。如使用菌落PCR，建议在95°C下进行最初5分钟变性。

5.5.退火时间可在15-60秒之间。退火温度常基于引物的Tm，通常为45-72℃。退火温度可以通过进行温度梯度PCR来优化，例如，比计算的Tm低5°C开始设置梯度。

5.6.建议的延伸温度为72°C。对于大多数模板，延伸时间通常为每kb 1分钟。

5.7.通常，25-35个循环能够产生足够的产物。检测低拷贝数的模板可能需要多达45个循环。

请注意，太多的循环会导致非特异性条带增多。

5.8.当退火温度高于72°C时，建议采用两步法。

5.9.Taq DNA聚合酶产生的PCR产物在3'端含有dA突出;因此，PCR产物可以连接到dT/dU-突出的载体上。