正常的活细胞带负电磷脂酰丝氨酸（PS）位于细胞膜的内侧。

• 一、Annexin V-FITC/PI双标法染色的原理

  正常的活细胞带负电磷脂酰丝氨酸（PS）位于细胞膜的内侧。细胞凋亡发生时，由于细胞膜磷脂对称性的改变而使PS外翻暴露于细胞膜外，成为巨噬细胞清除凋亡细胞识别的标志。Annexin V-FITC是一种标记有荧光素的钙依赖磷脂结合蛋白，与PS有很强的亲和力，可以特异的与PS结合。凋亡细胞保持了细胞膜的完整性。因而能与Annexin V-FITC结合。不能与PI结合。当细胞凋亡晚期或发生继发性坏死时，可以同时被Annexin V-FITC/PI着色，利用流式细胞仪进行双参数检测分析可以区分凋亡细胞和坏死细胞。

  

  磷脂酰丝氨酸（PS）与Annexin V-FITC结合过程如上图所示：

  二、 实验试剂和材料

  1. Annexin V-FITC（25μg/mL）。

  2. PI（250μg/mL）。

  3. 结合缓冲液（×10）（pH7.5 100mM Hepes，1.1M NaCl，2.5mM CaCl2）。

  三、实验操作步骤

  1. 收集待检测细胞，要准备未处理的细胞当作对照组。处理诱导的细胞当作样品组。

  2. 收集的细胞用2ml PBS重悬，1000r/min离心5min，细胞数要求每组1×106个细胞。弃上清。

  3. 用1×的100μl结合缓冲液重悬细胞，加入5μl的Annexin V-FITC和10μl的PI，混匀，避光4℃避光孵育30min。

  4. 上机检测。检测前补加结合缓冲液至总体积至500μl。

  四、 实验结果分析

  实验结果如下图所示

  

    A图为未处理细胞的凋亡         B图为处理诱导细胞的凋亡

  注：左上为坏死细胞，右上为晚期凋亡细胞，左下为活细胞，右下为早期凋亡细胞

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